骨髓炎动物模型构建的研究进展

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楼主 2019-01-16 05:26:09
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本文原载于《中华创伤骨科杂志》2017年第8

骨髓炎是骨科常见病,治疗难度大,给骨科医生带来极大的挑战。目前研究[1]表明葡萄球菌占感染的65%~80%。由于患者人群结构复杂,治疗方法多样,病原菌和相应的毒力机制特异,人体临床试验很难进行。虽然动物模型很难精确复制人类骨感染疾病发生、发展的特点,但是对各种动物模型特点和局限性的了解有助于临床医生和研究人员适当地选择动物模型,深入了解骨髓炎的病理机制、评价诊断方法,研究治疗方式的有效性,指导临床实践[2]

为此,本文总结金黄色葡萄球菌骨髓炎动物模型的研究文献,分析不同种类动物的特性,介绍置入物、开放性骨折、外固定相关和血源性金黄色葡萄球菌骨髓炎动物模型的制作,同时也探讨骨感染模型的评价方法。

骨髓炎动物模型各种动物的优势和缺陷

兔作为中型动物来说,相对便宜,很大一部分实验都用兔作为研究对象。它们的体型容易操作和管理,骨骼足够钢板和螺钉的应用,胫骨和股骨髓腔可以适应改良后的髓内钉和其他置入物。

大鼠作为兔和羊等中大型动物的替代,其成本低,供应充足,易于长周期实验的养殖和管理。大鼠长骨髓腔可以进行髓内钻孔和固定,但应用螺钉和钢板仍存在困难。此外,由于大鼠拥有极强的免疫系统,使感染模型复杂化,所以很少用来制作模拟急性骨髓炎的模型[3]

骨髓炎的发病过程与宿主的免疫系统有着非常密切的联系,随着对小鼠免疫系统功能和调节的深度了解,加之饲养管理成本低,小鼠正迅速成为研究骨髓炎的常用模型,但较小的体型使得在同一只小鼠体内进行2个阶段置入或多部位置入变得困难。随着近年来生物荧光成像技术的发展,小鼠模型的优势更加明显,生物荧光成像可实时纵向监测感染的程度,有助于研究人员解释细菌的代谢活动[4]

在骨髓炎研究中采用其他动物,如狗、绵羊、山羊等,较兔、大鼠和小鼠少见,它们体型更大,更昂贵且难以管理,但这些动物有更大的骨骼和关节,可应用更近似于人类的内固定物及假体。

骨髓炎动物模型的评价

评估骨感染模型的方法除了观察局部(红斑、肿胀或脓肿形成)或全身(热或嗜睡)感染的临床症状外,记录分析的其他指标还有:感染率、微生物学、组织学分析、X线片、血清炎性反应标记物或生物荧光成像,计算机断层扫描或磁共振成像扫描。

微生物学评价:传统量化细菌负荷的方法是菌落计数,但只能用于横断面研究。培养取自心脏内的血液样本,骨样本或棉签拭子从进针部位或金属置入材料表面取材的样本,当需进一步量化分级时,有研究[5]将骨样本进行粉碎,再把样本悬浮于无菌磷酸盐缓冲溶液,确定每克骨组织上细菌集落形成单位。为每克骨的细菌集落形成单位进行精确测量,近年来,有研究[6]行聚合酶链反应检测细菌DNA来间接量化细菌负荷。

感染模型也可通过影像学、大体和组织学来定性评估。影像学根据计分来评估骨感染[7],参照感染骨的骨膜反应,骨质溶解,软组织肿胀、畸形、死骨形成,自发骨折和总体印象。Rissing评分结合大体外观和影像学表现,将骨感染进行分级[8]:0级:没有明显证据的感染;1级:最小红斑,没有骨质破坏,无脓肿;2级:红斑并骨形成和少量骨破坏;3级:脓肿与新骨形成,骨破坏和脓性分泌物;4级:严重的骨吸收、脓肿,波及整个骨。对于骨样本的组织学检查,Huneault等[9]从骨膜增生、皮质重塑、骨内膜增殖、骨膜中性粒细胞炎性反应、骨膜淋巴细胞炎性反应、骨髓淋巴细胞炎性反应、死骨片和细菌几个方面来进行评估。

近年来,一些研究[4]利用在体生物荧光成像技术,使转基因细菌在新陈代谢过程中释放出光子,可跟踪lux操纵子(由荧光素酶基因及其底物合成酶基因组成)的改变,实时监测体内感染的程度和范围,提供进一步了解细菌代谢状态的方法,避免了处死动物,使得1项实验中需要的动物数量减少。更重要的是,研究者可通过观测同一动物体内感染细菌对干预的时间效应,而不需要比较a鼠在时间t与b鼠在时间t + 1感染的程度差异,使得动物可以自身对照,实验变异性大大减少,但只能间接评测细菌负荷仍是其缺陷。

不同骨髓炎动物模型的制作及优缺点

由于实验动物体型的差异,各部位骨感染模型的制作方法不同。骨髓炎模型的制备与菌种选择、细菌负荷、接种方法、置入物和骨损伤等因素密切相关。这些因素都存在较大的变异,造成标准化和量化困难,近年来各国研究者对此进行了不断改进。

一、置入物相关骨髓炎模型

早期有Norden[10]和Fitzgerald[11]报告的方法,Norden[10]采用18号注射器针头向兔胫骨注入质量百分比为5%的鱼肝油酸钠硬化剂,随后接种金黄色葡萄球菌制作胫骨慢性骨髓炎模型。Fitzgerald[11]于1983年制作了狗的慢性骨髓炎模型,在去除1 cm2皮质骨的窗口中,注入金黄色葡萄球菌,骨缺损处填入骨水泥,12周后每个标本的影像学、临床表现、组织学和微生物学指标均显示骨髓炎。虽然骨感染率高,但没有造成骨折,也没有应用置入物,不能很好地模拟临床情景。

模型构建时骨损伤的制作和置入物的应用存在不同方法。Andriole等[12]利用三爪钳制作兔胫骨骨折,力求骨折形态一致。Southwood等[13]采用兔股骨侧方入路,用磨锉制作10 mm的骨缺损,在其表面用钢板、2 mm皮质螺钉和钢丝环扎固定,成功制作合并骨缺损的置入物相关骨髓炎模型。Sottnik等[14]在小鼠胫骨近端横向皮质骨开孔,置入金黄色葡萄球菌接种的缝合线作为骨髓炎的来源。Li等[15]用不锈钢针接种金黄色葡萄球菌,通过胫骨干骺端由内侧到外侧横穿置入,其优点是不涉及膝关节,可致90%以上的小鼠局限性脓肿,具有高度可重复性,且没有检测到血液播散和败血症发生。

骨髓腔内局部接种方法有2种:骨钻孔后直接注入细菌悬液和置入物浸泡细菌悬液后置入。Subasi等[16]采用膝下正中入路暴露大鼠胫骨近端,内侧皮质钻孔,将一小段线或针尖置入骨髓腔后,直接注入细菌,用骨水泥封口,不用硬化剂,虽然成功制作了骨髓炎模型,但由于大鼠免疫系统反应强烈,与人类骨髓炎发生过程差异较大。Lucke等[17]设计的模型在置入金属置入物之前进行接种,将接种后的钢丝或针置入胫骨骨髓腔内,这种模型已被其他学者复制,能更准确地模拟人体骨髓炎的发生过程。

二、开放性骨折相关骨髓炎模型的制备

开放性骨折由于增加了污染伤口这一易变因素,模型制作的重复性及同质性难度加大。Ashhurst等[18]于1982年第一次报告了在兔的胫骨用锯造成骨折,使用钢板固定来制作开放性骨折模型。Worlock等[19]在此基础上进一步改进,制成髓内钉固定模型,107集落形成单位(colony forming unit,CFU)细菌作为最小剂量在骨折部位制作了一个污染的伤口,取得了较为一致的感染率(>80%),但其应用的髓内钉缺乏旋转稳定,不同于用于人体的髓内钉,后者有锁钉可以提供稳定。有研究[20]报道使用1 mm宽的锉在大鼠胫骨骨皮质制作一个1 cm长的纵向槽暴露髓腔,烧灼骨内膜中断血供,再接种细菌,不使用内置材料,成功制作了开放性骨髓炎模型,电热法造成骨热坏死、血管破坏,虽有利于骨髓炎的发生,但模拟临床情景差。为此,有学者[21]采用重块坠落于大鼠大腿造成股骨中段粉碎性骨折,接着侧方入路暴露骨折,放置髓内钉固定,骨折部位接种细菌,然后暴露于空气1 h,较好地模拟了临床治疗前暴露的创伤患者。

多数髓内钉固定开放性骨折模型的制作过程是在置入髓内钉之前于截骨部位接种细菌,然后病原体直接通过扩髓向骨折远端插入髓内钉时播散,但短时间大负荷接种细菌不能很好地模拟临床发生过程。Stewart等[22]在羊胫骨采用"V"形截骨制作开放性骨折,8 mm髓内钉固定,后将牛Ⅰ型胶原蛋白片放置于骨折部位,局部缓慢释放金黄色葡萄球菌培养液,这个模型较其他模型更好地模拟了人体髓内钉感染的临床并发症。

开放性骨折加之固定器械的使用,生物膜细菌感染几率增加,造成抗生素药物治疗效果差。为模拟细菌生物膜相关感染,Williams等[23]在羊的胫骨近端置入2个2 cm×2 cm金属板结合一耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜覆盖的高分子材料膜,成功制作了Gustilo-Anderson ⅢB型开放性骨折细菌生物膜感染相关模型,为治疗细菌生物膜感染提供了基础。

三、血源性骨髓炎模型

血源性骨髓炎模型的成功制作需要充分考虑动物物种、菌种选择、细菌的最小负荷及接种方法等相关因素。Morrissy和Haynes[24]首次报告兔胫骨近端骺创伤血源性骨髓炎动物模型,其制备方法是在胫骨近端部分施加三点应力制作一可重复的剪切损伤,然后静脉注入高细菌负荷(108 CFU),与单纯金黄色葡萄球菌菌血症组相比,损伤或骨折造成宿主局部区域的免疫系统薄弱,使得感染率提高。Poultsides等[25]在兔胫骨近端部分置入多孔钽金属的髓内置入物制作血源性感染模型,4周后行股动脉插管,导管进入到膝关节近端2 cm,注入1 mL细菌培养液,其发现低剂量接种不能持续可靠地引发感染,而更大量的5×108 CFU细菌接种则由于感染性休克导致动物死亡率为100%。所以选择注入细菌的最小负荷既能确保感染又不压倒动物的免疫系统是制作血源性骨髓炎模型的关键。Emslie等[26]报告经翼静脉注射金黄色葡萄球菌引发1个月龄鸡的急性血源性骨髓炎模型,24 h后96%的鸡出现骨髓炎表现。这种高度可重复的模型模拟了人类儿科常见的急性血源性骨髓炎,研究人员得以研究儿童骨髓炎的自然发展过程。Johansen等[27]研究猪经股动脉接种金黄色葡萄球菌分离株发展成急性血源性骨髓炎的潜力。通过计算机断层扫描、显微观测和肽核酸荧光原位杂交显示血源性骨髓炎的发生和生物膜的形成高度依赖于菌株的选择。

四、外固定支架骨感染模型

外固定支架由于固定钉钉道与外界相通,是感染的危险因素,但有关利用外固定支架来诱发骨髓炎的研究却很少。Clasper等[28]介绍制备羊的胫骨外固定器相关骨髓炎模型的方法。经皮肤置入3枚双皮质骨钢钉,将金黄色葡萄球菌菌液应用于钢钉周围伤口,仅1 h后观察到1组羊的钢钉置入骨干处有浑浊液体聚集,显示感染扩散。

因为影响骨髓炎的因素很多,如菌种选择、细菌负荷、接种方法、置入物和骨损伤等。因此,在构建缺损模型时,要尽量考虑到这些因素的影响。即使相同的菌株和菌量,在同一动物同一部位制造的骨髓炎差异也很大,所以骨髓炎模型很难进行量化比较,各研究间很难进行横向比较[29]

硬化剂的作用

Mendel等[30]最早应用鱼肝油酸钠作为硬化剂,帮助建立胫骨慢性骨髓炎模型。硬化剂可引起不可逆性血管内皮细胞损伤,导致血管纤维化、血管腔闭塞,造成局部缺血,影响机体局部免疫反应。常用的硬化剂有鱼肝油酸钠、花生四烯酸、十四烷基硫酸钠等。有文献[31]研究了硬化剂对造模的影响,通过单独使用金黄色葡萄球菌或硬化剂构建家兔慢性骨髓炎模型,发现成功率不高,而两者结合应用,成功率则大为提高。但是硬化剂的应用可能使结果发生偏倚,因为使用硬化剂后感染不能都归因于细菌,还要考虑到硬化剂的宿主反应。所以有关硬化剂的使用目前仍存在争议,部分研究者不使用硬化剂也制作出可重复的模型。

小结与展望

本文对构建金黄色葡萄球菌骨髓炎动物模型的文献进行了综述,包括各种动物物种的优劣、不同接种方法和骨感染的评价方法,如放射学、微生物学、大体和组织学评估以及硬化剂的作用。动物模型的制作应力求均质性和可复制性。虽然没有最理想的动物模型,但是越来越有效的接种方式和评估感染的手段,促进了对金黄色葡萄球菌骨髓炎的深入了解。这些动物模型已经为多项治疗和检测技术提供了基础。建立统一的骨髓炎动物模型定义、诊断"金标准"及感染细菌的量化标准亦是今后研究的方向。

“参考文献略”


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